Uji Aktivitas Enzim Amilase (Metode)

UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE

A.     Pendahuluan

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel.

Amilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa (Anonim, 2008). Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Enzim pada umumnya diproduksi oleh mikroorganisme melalui proses fermentasi. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Oliveira, 2004).

Menurut Biogen (2008), secara umum amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu:

Ü     Enzim alfa-amilase

merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul.

Ü     Enzim beta-amilase

atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung non-pereduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti.

Enzim beta-amilase banyak ditemukan pada tanaman tingkat tinggi, seperti gandum, ubi, dan kacang kedelai. Disamping itu, beta-amilase juga dapat ditemui pada beberapa mikroorganisme, antara lain Pseudomonas sp, Bacillus sp, Streptococcus sp, dan Clostridium thermosulfurigenes.

Ü     Glukoamilase

dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim alfa-amilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4.

Enzim amilase banyak digunakan pada industri makanan. Amilase dapat digunakan sebagai pengontrol viskositas sirup cokelat dan minuman beralkohol (brewing). Amilase diproduksi oleh banyak jenis mikrobia, akan tetapi mikrobia yang sering digunakan dalam skala industri adalah Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloquaifaciens dan Aspergillus niger (Inchem, 2008).

B.     Metode Uji Enzim Amilase

Beberapa langkah dalam metode di bawah ini dapat digunakan dalam skala laboratorium untuk menentukan aktivitas enzim amilase, yaitu sbb:

           A.      Ekstraksi enzim amilase

Ÿ         Suarni dan Rauf (2007)

1.      Sampel dihaluskan/ dihancurkan dengan blender

2.      Ditambah buffer asetat 0,2 M pH 5 (untuk setiap 1 gr sampel ditambah 5 ml buffer asetat).

3.      Disimpan selama 10 menit sambil sekali-sekali dikocok.

4.      Disaring dengan menggunakan kapas.

5.      Filtrat disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 2000 rpm pada suhu 5⁰C.

6.      Supernatan (ekstrak enzim) yang dihasilkan diukur volumenya dan ditempatkan ke dalam wadah steril untuk dianalisis.

Ÿ         Ramansyah dan Sudiana (2003)

1.      Sampel sebanyak 20 gr digerus.

2.      Sampel dilarutkan dalam 100 ml buffer fosfat (pH 5,5).

3.      Kemudian disentrifuse 9800 x g, dengan suhu 2^oC selama 20 menit.

4.      Supernatan kemudian digunakan sebagai ekstrak enzim, dan dapat disimpan pada suhu dingin sampai siap digunakan.

Ÿ         Kunamneni et. al (2005)

1.      Sampel ditambah dengan 50 ml aquades dan dikocok menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit kemudian disaring.

2.      Filtrat dan residu dipisahkan, dan residu diekstrak kembali dengan 50 ml aquades dan disaring.

3.      Filtrat dijadikan satu dan disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.

4.      Supernatan yang didapat digunakan sebagai sumber enzim dalam analisis.

           B.      Deteksi enzim amilase (Laloknam et. al, 2009)

1.      50 μl filtrat sampel ditambahkan pada lubang-lubang dalam starch agar (2.0 % agar dan 1% pati, pH 7.0).

2.      Diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit.

3.      Larutan iodin ditambahkan pada agar sehingga terlihat daerah terang yang terbentuk.

4.      Diameter daerah terang di sekitar lubang-lubang pada agar diukur.

5.    Dapat pula diukur aktivitas amilase berdasarkan selisih antara diameter daerah terang disekitar lubang dengan diameter lubang pada agar.

           C.      Uji aktivitas enzim amilase

Ÿ         AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007)

1.      1 ml filtrat enzim hasil ekstraksi ditambahkan dengan 1 ml larutan substrat/ pati (soluble starch).

2.      Diinkubasi selama 3 menit pada suhu optimum 30⁰C.

3.      Ditambah dengan 2 ml DNS (3,5 dinitro salicilic acid) kemudian dipanaskan sampai mendidih, didinginkan cepat pada air mengalir dan ditambah 20 ml aquades.

4.      Serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

Aktivitas enzim alfa-amilase = C x 1/T x 1 unit/1 mikromol

dimana:

C = konsentrasi maltosa per ml ekstrak enzim (mikromol)

T = waktu inkubasi (menit)

1 unit enzim α-amilase = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 mikromol maltosa per menit per ml enzim

Ÿ        

Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993)

1.      Ke dalam tabung-tabung percobaan (sampel dan blanko), dimasukkan 2 ml larutan substrat pati dalam buffer asetat pH 6,0 ditempatkan pada penangas air dengan temperatur 37⁰C selama 5 menit.

2.      Campuran ditambah 0,05 ml larutan enzim memakai pipet, dikocok beberapa lama, lalu diinkubasi pada temperatur 37⁰C selama 15 menit.

3.      Setelah campuran diinkubasi, dengan segera ditambahkan 20 ml aquades dan 1,0 ml larutan I₂ 0,008 N.

4.      Campuran dikocok beberapa lama hingga tercampur sempurna.

5.      Dibiarkan 10 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm.

* Larutan substrat yang digunakan mengandung 0,2 gr Amilosa, 15mM NaCl dan 20 mM buffer asetat pH 6,0.

* Perhitungan memakai satuan ”Street-Close”/ 100 ml.

* Satu satuan S.C. = jumlah enzim yang dapat menghidrolisis 20 mikromol amilosa dalam waktu 15 menit pH 6,0 dengan temperatur 37⁰C.

  Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009)

1.      Gelatinisasi larutan pati yang digunakan untuk substrat.

-         Sebanyak 40 ml larutan pati 1% (Soluble starch) ditambahkan dalam 50 ml air medidih di gelas beaker sambil diaduk.

-         Larutan kemudian didinginkan hingga mencapai suhu ruang.

-         Ditambah dengan aquades hingga volume tepat 100 ml.

2.      Pembuatan larutan baku/ standar (stock solution)

-         Larutan gelatinisasi pati diambil sebanyak 1 ml.

-         Ditambah aquades hingga volume tepat 100 ml kemudian dihomogenkan.

3.      Pembuatan Kurva Standar dan Uji Amilase

-         Larutan baku diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan dalam 3 tabung reaksi.

-         Ditambah 3 ml buffer fosfat 0,1 M pH 5,6.

-         Ditambah 1,5 ml ekstrak amilase dan campuran diinkubasi pada suhu 37°C.

-         Setelah diinkubasi, campuran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan pada tabung reaksi yang berisi 3 ml HCl 10% untuk menghentikan reaksi.

-         Ditambah 3 ml indikator (larutan iodin – kalium iodida).

-         Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm.

-         Prosedur diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit.

-         Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.

C.     Analisa Prosedur

Aktivitas alfa-amilase secara umum ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan pengurangan derajat pewarnaan iodium terhadap substrat. Pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan iodium menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bereaksi dengan iodium berwana coklat. Keaktifan alfa-amilase juga dapat dinyatakan dengan pengukuran viskositas dan jumlah produksi yang terbentuk. Laju hidrolisis akan meningkat bila polimerisasi menurun dan laju hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus (Winarno, 1986).

Metode untuk analisa enzim amilase di atas memiliki prinsip yang sama, yaitu mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim amilase dalam waktu tertentu.

1.      Analisa Prosedur Ekstraksi Enzim Amilase:

Prinsip utama dalam ekstraksi enzim amilase adalah mengambil enzim amilase yang terdapat pada sampel dengan pelarut (buffer atau akuades). Enzim amilase diharapkan dapat larut sempurna pada pelarut yang digunakan. Amilase yang larut kemudian disentrifuse dengan kecepatan tinggi selama beberapa menit agar residu sampel tidak ikut ter-analisa pada saat pengujian aktivitas enzim. Setelah disentrifuse, sisa residu dalam sampel (yang lolos dari penyaringan) akan mengendap di dasar tabung sentrifuse sedangkan supernatan yang didapat merupakan enzim amilase beserta pelarut yang kemudian akan digunakan untuk analisa selanjutnya.

Pada metode di atas digunakan pelarut buffer asetat 0,2 M pH 5, buffer fosfat (pH 5,5), serta akuades. Perbedaan penggunaan pelarut dapat bergantung pada sampel yang digunakan selain itu penggunaan buffer bertujuan agar enzim yang di dapat tetap stabil. Namun, Laloknam et. al (2009) menyebutkan bahwa penggunaan larutan buffer atau akuades memiliki fungsi yang sama dan keduanya dapat juga dipakai sebagai kontrol negatif aktivitas enzim amilase.

2.      Analisa Prosedur Deteksi Enzim Amilase:

Prinsip utama dalam mendeteksi keberadaan enzim amilase adalah hidrolisis pati (starch) yang ditandai dengan daerah terang pada agar di sekitar lubang yang telah ditetesi sampel. Starch agar yang dibuat mengandung pati yang merupakan karbohidrat kompleks. Enzim amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase dapat mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa. Enzim amilase pada sampel akan menghidrolisis pati pada agar. Hal ini dapat diketahui dengan terlihatnya daerah terang pada starch agar. Penambahan larutan iodin pada agar bertujuan untuk memperjelas daerah terang yang terbentuk. Aktivitas enzim amilase masing-masing sampel juga dapat ditentukan dengan perbandingan diameter daerah terang yang terbentuk pada agar.

3.      Analisa Prosedur Uji Aktivitas Enzim Amilase:

ü      AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007)

Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 3 menit dan suhu optimum 30^oC. Reaksi kemudian dihentikan dengan penambahan DNS (3,5 dinitro salicilic acid). Selain itu reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) akan bereaksi dengan gula pereduksi hasil hidrolisis dan mengakibatkan terbentuknya warna tertentu. Sampel kemudian didihkan agar reagen DNS dapat bekerja dengan cepat, setelah itu didinginkan dengan air mengalir. Penambahan 20 ml akuades untuk pengenceran sampel. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 550 nm. Metode ini terlebih dahulu membuat kurva standar glukosa antara konsentrasi glukosa dalam berbagai macam konsentrasi dan absorbansi. Kemudian konsentrasi sampel yang didapat melalui kurva standar dimasukkan ke dalam rumus untuk mendapatkan aktivitas enzim amilase.

ü      Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993)

Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 5 menit dan suhu optimum 37^oC. Penambahan akuades sebanyak 20 ml bertujuan untuk mengencerkan sampel. Setelah itu, ditambahkan larutan I₂. Larutan I₂ akan bereaksi dengan sisa pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim amilase dan menghasilkan warna biru. Semakin banyak pati yang tersisa berarti aktivitas enzim amilase semakin kecil, dengan ditandai dengan degradasi warna biru. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Aktivitas enzim diukur dengan memasukkan nilai absorbansi ke dalam rumus, dengan satuan aktivitas enzim adalah S.C. (”Street-Close”).

ü      Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009)

Tahap pertama metode ini adalah gelatinisasi atau likuifikasi pati sehingga menghasilkan larutan starch yang baku. Larutan ini kemudian digunakan sebagai substrat dalam mereaksikan dengan sampel yang mengandung enzim amilase. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu tertentu dan suhu optimum 37^oC. Reaksi ini kemudian dhentikan dengan menambahkan larutan HCl 10%. Setelah itu ditambahkan indikator iodin-kalium iodida. Menurut Teodoro dan Meire (2000), larutan indikator dibuat dengan 0,05% iodin dalam 0. 5% KI. Sisa pati yang tidak terhidrolisis akan bereaksi dengan indikator sehingga menghasilkan warna tertentu. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Proses tersebut merupakan pengukuran pada jam ke-0. Langkah pengujian aktivitas enzim diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit. Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu kemudian diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.

D.    Penutup

Metode pengukuran aktivitas enzim amilase di atas memiliki prinsip utama yang sama, yaitu mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim amilase dalam waktu tertentu. Pengukuran hasil hidrolisis substrat yaitu monosakarida (gula reduksi) menggunakan reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid), sedangkan pengukuran sisa substrat (pati) yang tidak bereaksi dengan enzim menggunakan larutan I₂ atau indikator iodin-kalium iodida. Serapan pada sampel yang terbentuk diukur pada panjang gelombang tertentu. Untuk pengukuran menggunakan reagen DNS diukur pada panjang gelombang 550 nm, sedangkan jika menggunakan larutan I₂ atau indikator iodin-kalium iodida diukur pada panjang gelombang 620 nm.

DAFTAR PUSTAKA

Afiukwa, et. al. 2009. Determination of amylase activity of crude extract from partially germinated mango seeds (Mangifera oraphila). African Journal of Biotechnology Vol. 8 (14), pp. 3294-3296, 20 July, 2009. ISSN 1684–5315. Available online at http://www.academicjournals.org/AJB.

Anonim. 2008. Amilase. Tersedia dalam http://ptp2007.wordpress.com/2008/05/15/amilase/. diakses tanggal 28 November 2011

Biogen. 2008. Amilase. Tersedia dalam http://biogen.litbang.deptan.go.id/terbitan/agrobio/abstrak/agrobio_vol.           diakses tanggal 28 November 2011.

Inchem. 2008. Alpha-Amylase From Bacillus Subtilis. Tersedia dalam http://www.inchem.org/ documents/jecfa/jecmono/v28je05.htm. diakses tanggal 28 November 2011.

Kunamneni, Adinarayana et. al. 2005. Amylase Production in Solid State Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces lanuginosus. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 100, No. 2, 168- 171. DOI: 10.1263/jbb.100.168. The Society for Biotechnology, Japan.

Laloknam, Surasak et.al. 2009. Detection of amylase activity from fruit and vegetables in an undergraduate classroom. As. J. Food Ag-Ind. 2009, 2(03), 381-390. ISSN 1906-3040. Available online at www.ajofai.info

Oliveira. 2004. Rhizobia Amylase Production Using Various Starchy Substances as Carbon Substrates. Tersedia dalam http://www.scielo.br/pdf/bjm/v31n4/a11v31n4.pdf. diakses tanggal 28 November 2011.

Ramansyah, Maman dan I Made Sudiana. 2003. Optimasi Analisis Amilase Dan Glukanase Yang Diekstrak Dari Miselium Pleurotus ostreatus Dengan Asam 3,5 Dinitrosalisilat. Berk. Penel. Hayati: 9 (7-12). 2003

Soeka, Yati Sudaryati dan Eddy Djajasukma. 1993. Pengaruh Penambahan Sumber-Sumber Nitrogen Terhadap Aktivitas Enzim Alpha-Amilase Aspergillus niger Dalam Media Campuran Onggok dan Dedak. Pros. Seminar Hasil Litbang SDH 14 Juni 1993

Suarni dan Rauf Patong. 2007. Potency of Mung Bean Sprout As Enzyme Source (α-amilase). Indo. J. Chem., 2007, 7 (3), 332-336

Teodoro, Carlos Eduardo de Souza and Meire Lelis Leal Martins. 2000. Culture Conditions For The Production Of Thermostable Amylase by Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology (2000) 31:298-302. ISSN 1517-8382

Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia

Titrasi Pengendapan

Titrasi pengendapan merupakan titrasi yang melibatkan pembentukan endapan dari garam yang tidak mudah larut antara titrant dan analit. Hal dasar yang diperlukan dari titrasi jenis ini adalah pencapaian keseimbangan pembentukan yang cepat setiap kali titran ditambahkan pada analit, tidak adanya interferensi yang menggangu titrasi, dan titik akhir titrasi yang mudah diamati.

Salah satu jenis titrasi pengendapan yang sudah lama dikenal adalah melibatkan reaksi pengendapan antara ion halida (Cl-, I-, Br-) dengan ion perak Ag+. Titrasi ini disebut sebagai Argentometri yaitu titrasi penentuan analit yang berupa ion halida (pada umumnya) dengan menggunakan larutan standart perak nitrat; AgNO₃.

Dasar titrasi argentometri adalah pembentukan endapan yang tidak mudah larut antara titran dengan analit. Sebagai contoh yang banyak dipakai adalah titrasi penentuan NaCl dimana ion Ag+ dari titran akan bereaksi dengan ion Cl- dari analit membentuk garam yang tidak mudah larut AgCl.

AgNO₃ + NaCl → AgCl + NaNO₃

Setelah semua ion klorida dalam analit habis maka kelebihan ion perak akan bereaksi dengan indikator. Indikator yang dipakai biasanya adalah ion kromat (CrO₄^2-) dimana dengan indikator ini ion perak akan membentuk endapan berwarna coklat kemerahan sehingga titik akhir titrasi dapat diamati. Indikator lain yang bisa dipakai adalah tiosianida dan indikator adsorbsi. Berdasarkan jenis indikator dan teknik titrasi yang dipakai maka titrasi argentometri dapat dibedakan atas Argentometri dengan metode Mohr, Volhard, atau Fajans. Selain menggunakan jenis indikator diatas dapat juga menggunakan metode potensiometri untuk menentukan titik ekuivalen.

a)      Metode Mohr

Metode Mohr biasanya digunakan untuk menitrasi ion halida seperti NaCl, dengan AgNO₃ sebagai titran dan K₂CrO_4­ sebagai indikator. Titik akhir titrasi ditandai dengan adanya perubahan warna suspensi dari kuning menjadi kuning coklat. Perubahan warna tersebut terjadi karena timbulnya Ag₂CrO₄, saat hampir mencapai titik ekivalen, semua ion Cl^- hampir berikatan menjadi AgCl. Larutan standar yang digunakan dalam metode ini, yaitu AgNO₃.

Pada analisa Cl^- mula-mula terjadi reaksi:

Ag⁺_(aq) + Cl^-_(aq) ↔ AgCl_(s)↓

Sedang pada titik akhir, titran juga bereaksi menurut reaksi:

2Ag⁺_(aq) + CrO_4(aq) ↔ Ag₂CrO_4(s)↓

       Pengaturan pH sangat perlu, agar tidak terlalu rendah ataupun tinggi. Bila terlalu tinggi, dapat terbentuk endapan AgOH yang selanjutnya terurai menjadi Ag₂O sehingga titran terlalu banyak terpakai.

2Ag⁺_(aq) + 2OH^-_(aq) ↔ 2AgOH_(s)↓ ↔ Ag₂O_(s)↓ + H₂O_(l)

Bila pH terlalu rendah, ion CrO₄^- sebagian akan berubah menjadi Cr₂O₇^2- karena reaksi

2H⁺_(aq) + 2CrO4^2-_(aq) ↔ Cr₂O₇^2- +H₂O_(l)

Yang mengurangi konsentrasi indikator dan menyebabkan tidak timbul endapannya atau sangat terlambat.

Selama titrasi Mohr, larutan harus diaduk dengan baik. Bila tidak, maka secara lokal akan terjadi kelebihan titrant yang menyebabkan indikator mengendap sebelum titik ekivalen tercapai, dan dioklusi oleh endapan AgCl yang terbentuk kemudian; akibatnya ialah, bahwa titik akhir menjadi tidak tajam.

b)      Metode Volhard

Metode Volhard menggunakan NH₄SCN atau KSCN sebagai titrant, dan larutan Fe³⁺ sebagai indikator. Sampai dengan titik ekivalen harus terjadi reaksi antara titrant dan Ag, membentuk endapan putih.

Ag⁺_(aq) + SCN^-_(aq) ↔ AgSCN_(s)↓ (putih)

Sedikit kelebihan titrant kemudian bereaksi dengan indikator, membentuk ion kompleks yang sangat kuat warnanya (merah)

SCN^-_(aq) + Fe³⁺_(aq) ↔ FeSCN²⁺_(aq)

Yang larut dan mewarnai larutan yang semula tidak berwarna.

Karena titrantny SCN^- dan reaksinya berlangsung dengan Ag⁺, maka dengan cara Volhard, titrasi langsung hanya dapat digunakan untuk penentuan Ag⁺ dan SCN^- sedang untuk anion-anion lain harus ditempuh cara titrasi kembali: pada larutan X^- ditambahkan Ag⁺ berlebih yang diketahui pasti jumlah seluruhnya, lalu dititrasi untuk menentukan kelebihan Ag⁺. Maka titrant selain bereaksi dengan Ag⁺ tersebut, mungkin bereaksi pula dengan endapan AgX:

Ag⁺_(aq) (berlebih) + X^- _(aq) ↔ AgX_(s) ↓

Ag⁺_(aq) (kelebihan) + SCN^- _(aq) (titrant) ↔ AgSCN_(s) ↓

SCN^-_(aq)  + AgX _(s) ↔ X^-_(aq) + AgSCN_(aq) ↓

Bila hal ini terjadi, tentu saja terdapat kelebihan titrant yang bereaksi dan juga titik akhirnya melemah (warna berkurang).

Konsentrasi indikator dalam titrasi Volhard juga tidak boleh sembarang, karena titrant bereaksi dengan titrat maupun dengan indikator, sehingga kedua reaksi itu saling mempengaruhi.

Penerapan terpenting cara Volhard ialah untuk penentuan secara tidak langsung ion-ion halogenida: perak nitrat standar berlebih yang diketahui jumlahnya ditambahkan sebagai contoh,  dan kelebihannya ditentukan dengan titrasi kembali dengan tiosianat baku. Keadaan larutan yang harus asam sebagai syarat titrasi Volhard merupakan keuntungan dibandingkan dengan cara-cara lain penentuan ion halogenida karena ion-ion karbonat, oksalat, dan arsenat tidak mengganggu sebab garamnya larut dalam keadaan asam.

c)      Metode Fajans

Apabila suatu senyawa organik berwarna diserap pada permukaan suatu endapan, perubahan struktur organik mungkin terjadi, dan warnanya sebagian besar kemungkinan telah berubah dan mungkin menjadi lebih jelas. Peristiwa ini dapat dipakai untuk mengetahui titik akhir dari titrasi pengendapan garam-garam perak. Senyawa organik yang dipergunakan demikian, disebut sebagai “indikator adsorpsi”.

Cara kerja indikator adsorpsi ialah sebagai berikut: indikator ini ialah asam lemah atau basa lemah organik yang dapat membentuk endapan dengan ion perak. Misalnya fluoresein yang digunakan dalam titrasi ion klorida. Dalam larutan, fluoresein akan mengion (untuk mudahnya ditulis HFl saja).

HFl_(aq) ↔ H⁺_(aq) +Fl^-_(aq)

Ion Fl^- inilah yang diserap oleh endapan AgX dan menyebabkan endapan berwarna merah muda. Karena penyerapan terjadi pada permukaan, dalam titrasi ini diusahakan agar permukaan endapan itu seluas mungkin supaya perubahan warna yang tampak sejelas mungkin, maka endapan harus berukuran koloid. Penyerapan terjadi apabila endapan yang koloid itu bermuatan positif, dengan perkataan lain setelah sedikit kelebihan titrant (ion Ag⁺).

Pada percobaan ini digunakan metode Mohr dan Volhard. Faktor-faktor penting yang   mempengaruhi kelarutan padatan kristalin antara lain :

1.      Suhu

2.      Pelarut

3.      Pengaruh ion senama

4.      Pengaruh ion tak senama

5.      Pengaruh pH

6.      Pengaruh hidrolisa

7.      Pengaruh kompleks

for example

Aktivitas Total Antioksidan Buah Pepaya Gunung (Carica pubescens)

Ditinjau dari Pengaruh Suhu dan Masa Panen 

1.      PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Sayuran dan buah-buahan telah digunakan sebagai bahan-bahan alami untuk menjaga kesehatan manusia karena dapat membantu mengurangi resiko dari banyak penyakit degeneratif yang berkaitan dengan usia. Banyak buah-buahan segar dan sayuran ditemukan mengandung antioksidan alami, terutama senyawa fenolik seperti asam ferulat, katekin, dan asam askorbat (vitamin C) (Long, 2010). Antioksidan didefinisikan sebagai inhibitor yang bekerja menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif yang relatif stabil . Antioksidan bertindak dengan satu atau lebih dari mekanisme berikut: mereduksi aktivitas radikal bebas, penangkapan radikal bebas, berpotensi membentuk kompleks logam pro-oksidan dan quenching oksigen singlet (Tachakittirungrod et. al., 2006).

Pepaya gunung (Carica pubescens) atau sering disebut dengan pepaya mini merupakan sumber antioksidan alami yang diperlukan tubuh. Pepaya mini ini tumbuh berkembang normal dan menghasilkan buah yang baik di Dataran Tinggi Dieng, Wonosobo, Jawa Tengah. Buah ini merupakan buah konsumsi lokal dalam jumlah terbatas. Menurut Carrasco (2008), dalam penelitiannya menunjukkan bahwa kandungan senyawa fenolik total buah ini cukup tinggi yaitu 167 mg ekivalen asam galat/ g buah serta kandungan vitamin C (asam askorbat) yaitu 31,41 mg/100g. Asam askorbat merupakan antioksidan yang efektif karena mampu menangkap radikal bebas; seperti superoksida dan 1-diphenil-2-picrilhidrazil (DPPH), dibanding dengan senyawa flavon (naringin dan hesperidin) serta β-kriptoxantin (Kondo et.al., 2005).

Aktivitas antioksidan pada buah umumnya menurun seiring dengan kematangan buah (Srilaong and Tatsumi, 2003). Untuk mengatasi hal tersebut kebanyakan buah pascapanen disimpan dalam suhu yang rendah. Penyimpanan pada suhu rendah dapat mengurangi kegiatan respirasi dan metabolisme, memperlambat proses penuaan, mencegah kehilangan air dan mencegah kelayuan. Tetapi hal ini juga bergantung pada spesies buah tersebut, Wang (2009) di dalam penelitiannya menunjukkan bahwa buah raspberry merah yang setengah masak memiliki kandungan antioksidan yang lebih tinggi daripada buah yang masak, sedangkan Sáenz (2010) menyatakan bahwa buah delima yang lebih matang memiliki kandungan fenolik dan kapasitas antioksidan lebih besar daripada buah mentah. Sehingga dalam hal ini diperlukan penetapan masa panen yang optimal untuk memaksimalkan potensi antioksidan dan dengan demikian meningkatkan kualitas buah selama penyimpanan pascapanen.

Di Indonesia, studi pemanfaatan buah pepaya gunung (Carica pubescens)  dan penetapan kadar senyawa antioksidan yang terkandung dinilai masih sangat kurang. Padahal, apabila buah ini dapat dikembangkan maka secara signifikan pastilah hal ini akan membawa dampak positif, baik bagi lingkungan, kesehatan dan perekonomian.

1.2  Tujuan

Berdasarkan latar belakang di atas, maka tujuan dari penelitian ini adalah :

·        Menentukan nilai aktivitas total antioksidan pada buah papaya gunung (Carica pubescens).

·      Mengidentifikasi hubungan antara aktivitas total antioksidan dan penyimpanan buah pada suhu rendah berdasarkan masa panen buah pepaya gunung (Carica pubescens).

Pengukuran Kesadahan (Titrimetri)

Salah satu tipe reaksi kimia yang berlaku sebagai dasar penentuan titrimetrik melibatkan pembentukan (formasi) kompleks atau ion kompleks yang larut namun sedikit terdisosiasi. Kompleks yang dimaksud di sini adalah kompleks yang dibentuk melalui reaksi ion logam, sebuah kation, dengan sebuah anion atau molekul netral. Titrasi kompleksometri merupakan titrasi berdasarkan pembentukan persenyawaan kompleks (ion kompleks atau garam yang sukar mengion), Kompleksometri merupakan jenis titrasi dimana titran dan titrat saling mengkompleks, membentuk hasil berupa kompleks. Kompleksometri juga dikenal sebagai titrasi kelatometri, seperti yang menyangkut penggunaan EDTA.

Asam etilen diamin tetra asetat atau yang lebih dikenal dengan EDTA, merupakan salah satu jenis asam amina polikarboksilat. EDTA sebenarnya adalah ligan seksidentat yang dapat berkoordinasi dengan suatu ion logam lewat kedua nitrogen dan keempat gugus karboksil-nya atau disebut ligan multidentat yang mengandung lebih dari dua atom koordinasi per molekul, misalnya asam 1,2-diaminoetanatetraasetat (asam etilena diamina tetra asetat, EDTA) yang mempunyai dua atom nitrogen – penyumbang dan empat atom oksigen penyumbang dalam molekul. Suatu EDTA dapat membentuk senyawa kompleks yang mantap dengan sejumlah besar ion logam sehingga EDTA merupakan ligan yang tidak selektif. Dalam larutan yang agak asam, dapat terjadi protonasi parsial EDTA tanpa pematahan sempurna kompleks logam, yang menghasilkan spesies seperti CuHY-. Ternyata bila beberapa ion logam yang ada dalam larutan tersebut dititrasi dengan EDTA akan menunjukkan jumlah semua ion logam yang ada dalam larutan tersebut.

Titrasi dapat ditentukan dengan adanya penambahan indikator yang berguna sebagai tanda tercapai titik akhir titrasi. Ada lima syarat suatu indikator ion logam dapat digunakan pada pendeteksian visual dari titik-titik akhir yaitu reaksi warna harus sedemikian sehingga sebelum titik akhir, bila hampir semua ion logam telah berkompleks dengan EDTA, larutan akan berwarna kuat. Kedua, reaksi warna itu haruslah spesifik (khusus), atau sedikitnya selektif. Ketiga, kompleks-indikator logam itu harus memiliki kestabilan yang cukup, kalau tidak, karena disosiasi, tak akan diperoleh perubahan warna yang tajam. Namun, kompleks-indikator logam itu harus kurang stabil dibanding kompleks logam-EDTA untuk menjamin agar pada titik akhir, EDTA memindahkan ion-ion logam dari kompleks-indikator logam ke kompleks logam-EDTA harus tajam dan cepat. Kelima, kontras warna antara indikator bebas dan kompleks-indikator logam harus sedemikian sehingga mudah diamati. Indikator harus sangat peka terhadap ion logam (yaitu, terhadap pM) sehingga perubahan warna terjadi sedikit mungkin dengan titik ekuivalen.

Indikator yang digunakan dalam titrasi ini adalah indikator EBT (Eriochrome Black T). Kelat logam terbentuk dengan molekul EBT dengan kehilangan ion hidrogen dari gugus –OH fenolik dan pembentukan ikatan antara ion logam dan baik atom-atom oksigen maupun gugus azo. Molekulnya biasanya dinyatakan dalam bentuk singkatan sebagai asam tribasik H₃In. Kebanyakan titrasi EDTA dilakukan dalam buffer dengan pH 8 sampai 10, yaitu batas jangkau indikator EBT (Eriochrome Black T) dengan brntuk HIn^2- yang berada dalam jumlah terbanyak. Reaksi yang menyebabkan perubahan warna dapat dituliskan:

MIn^-   +   HY^3-   Û   MY^2-   +    HIn^2-

                                     Merah                                             Biru

Agar perubahan warna terjadi pada harga pM yang sesuai maka stabilitas kompleks MIn^- harus lebih kecil dari stabilitas MY^2- sehingga logam melepaskan indikator apabila hanya sedikit berlebihan EDTA ditambahkan.

Air yang mengandung ion Ca²⁺, Mg²⁺, dan atau Fe³⁺/Fe²⁺ dikenal sebagai air sadah tetap. Sedangkan air yang mengandung ion HCO₃^- disebut air sadah sementara. Kerugian air sadah adalah mengganggu pembentukan busa sabun karena terbentuk endapan dengan ion stearat yang ada dalam sabun.

Ca²⁺ + 2 C₁₇H₃₅COO^-  →  Ca(C₁₇H₃₅COO)₂

Sedang kesadahan sementara dapat dihilangkan dengan pendidihan sehingga air tidak mengandung ion Ca²⁺ lagi karena terbentuk endapan.

Ca²⁺ + 2 HCO₃^-  →  CaCO₃ + H₂O + CO₂

Kesadahan tetap adalah besarnya kadar Mg²⁺ atau Ca²⁺ dalam air sadah. Bila ditentukan jumlah kedua kation, maka dapat ditentukan kesadahan tetap dan juga kesadahan parsial, yaitu kadar Mg²⁺ atau Ca²⁺ saja. Pada penentuan kesadahan contoh air sadah, diperlukan sedikit modifikasi dari cara titrasi langsung Mg-Ca murni, karena air dari alam sering dijumpai pengotoran oleh ion besi dan logam – logam lain. Bila digunakan EBT atau Calmagite sebagai indikator, maka akan terjadi blocking indikator oleh ion besi karena bereaksi secara irreversibel. Oleh karena itu digunakan buffer pH 10 yang dapat menyingkirkan ion besi sebagai endapan (mengendapkan ion besi) bila jumlahnya kecil. Sedangkan bila jumlahnya lebih banyak maka digunakan natrium sianida untuk mencegah gangguan oleh ion besi maupun ion tembaga.

Kesadahan air dapat ditentukan dengan titrasi kompleksometri. Larutan ion Mg2+ dan ion Ca2+ dititar dengan larutan EDTA dan digunakan indikator EBT (Eriochrome Black T). Pertama-tama EDTA akan bereaksi dengan ion Ca2+ ,kemudian dengan ion Mg2+ dan akhirnya dengan senyawa rangkai Mg-EBT yang berwarna merah anggur. Titik akhir pada pH 7-11, dengan adanya perubahan warna dari merah anggur menjadi biru yang berasal dari larutan penunjuk yang bebas.