Uji Aktivitas Enzim Amilase (Metode)

UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE

A.     Pendahuluan

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel.

Amilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa (Anonim, 2008). Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Enzim pada umumnya diproduksi oleh mikroorganisme melalui proses fermentasi. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Oliveira, 2004).

Menurut Biogen (2008), secara umum amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu:

Ü     Enzim alfa-amilase

merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul.

Ü     Enzim beta-amilase

atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung non-pereduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti.

Enzim beta-amilase banyak ditemukan pada tanaman tingkat tinggi, seperti gandum, ubi, dan kacang kedelai. Disamping itu, beta-amilase juga dapat ditemui pada beberapa mikroorganisme, antara lain Pseudomonas sp, Bacillus sp, Streptococcus sp, dan Clostridium thermosulfurigenes.

Ü     Glukoamilase

dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim alfa-amilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4.

Enzim amilase banyak digunakan pada industri makanan. Amilase dapat digunakan sebagai pengontrol viskositas sirup cokelat dan minuman beralkohol (brewing). Amilase diproduksi oleh banyak jenis mikrobia, akan tetapi mikrobia yang sering digunakan dalam skala industri adalah Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloquaifaciens dan Aspergillus niger (Inchem, 2008).

B.     Metode Uji Enzim Amilase

Beberapa langkah dalam metode di bawah ini dapat digunakan dalam skala laboratorium untuk menentukan aktivitas enzim amilase, yaitu sbb:

           A.      Ekstraksi enzim amilase

Ÿ         Suarni dan Rauf (2007)

1.      Sampel dihaluskan/ dihancurkan dengan blender

2.      Ditambah buffer asetat 0,2 M pH 5 (untuk setiap 1 gr sampel ditambah 5 ml buffer asetat).

3.      Disimpan selama 10 menit sambil sekali-sekali dikocok.

4.      Disaring dengan menggunakan kapas.

5.      Filtrat disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 2000 rpm pada suhu 5⁰C.

6.      Supernatan (ekstrak enzim) yang dihasilkan diukur volumenya dan ditempatkan ke dalam wadah steril untuk dianalisis.

Ÿ         Ramansyah dan Sudiana (2003)

1.      Sampel sebanyak 20 gr digerus.

2.      Sampel dilarutkan dalam 100 ml buffer fosfat (pH 5,5).

3.      Kemudian disentrifuse 9800 x g, dengan suhu 2^oC selama 20 menit.

4.      Supernatan kemudian digunakan sebagai ekstrak enzim, dan dapat disimpan pada suhu dingin sampai siap digunakan.

Ÿ         Kunamneni et. al (2005)

1.      Sampel ditambah dengan 50 ml aquades dan dikocok menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit kemudian disaring.

2.      Filtrat dan residu dipisahkan, dan residu diekstrak kembali dengan 50 ml aquades dan disaring.

3.      Filtrat dijadikan satu dan disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit.

4.      Supernatan yang didapat digunakan sebagai sumber enzim dalam analisis.

           B.      Deteksi enzim amilase (Laloknam et. al, 2009)

1.      50 μl filtrat sampel ditambahkan pada lubang-lubang dalam starch agar (2.0 % agar dan 1% pati, pH 7.0).

2.      Diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit.

3.      Larutan iodin ditambahkan pada agar sehingga terlihat daerah terang yang terbentuk.

4.      Diameter daerah terang di sekitar lubang-lubang pada agar diukur.

5.    Dapat pula diukur aktivitas amilase berdasarkan selisih antara diameter daerah terang disekitar lubang dengan diameter lubang pada agar.

           C.      Uji aktivitas enzim amilase

Ÿ         AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007)

1.      1 ml filtrat enzim hasil ekstraksi ditambahkan dengan 1 ml larutan substrat/ pati (soluble starch).

2.      Diinkubasi selama 3 menit pada suhu optimum 30⁰C.

3.      Ditambah dengan 2 ml DNS (3,5 dinitro salicilic acid) kemudian dipanaskan sampai mendidih, didinginkan cepat pada air mengalir dan ditambah 20 ml aquades.

4.      Serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

Aktivitas enzim alfa-amilase = C x 1/T x 1 unit/1 mikromol

dimana:

C = konsentrasi maltosa per ml ekstrak enzim (mikromol)

T = waktu inkubasi (menit)

1 unit enzim α-amilase = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 mikromol maltosa per menit per ml enzim

Ÿ        

Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993)

1.      Ke dalam tabung-tabung percobaan (sampel dan blanko), dimasukkan 2 ml larutan substrat pati dalam buffer asetat pH 6,0 ditempatkan pada penangas air dengan temperatur 37⁰C selama 5 menit.

2.      Campuran ditambah 0,05 ml larutan enzim memakai pipet, dikocok beberapa lama, lalu diinkubasi pada temperatur 37⁰C selama 15 menit.

3.      Setelah campuran diinkubasi, dengan segera ditambahkan 20 ml aquades dan 1,0 ml larutan I₂ 0,008 N.

4.      Campuran dikocok beberapa lama hingga tercampur sempurna.

5.      Dibiarkan 10 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm.

* Larutan substrat yang digunakan mengandung 0,2 gr Amilosa, 15mM NaCl dan 20 mM buffer asetat pH 6,0.

* Perhitungan memakai satuan ”Street-Close”/ 100 ml.

* Satu satuan S.C. = jumlah enzim yang dapat menghidrolisis 20 mikromol amilosa dalam waktu 15 menit pH 6,0 dengan temperatur 37⁰C.

  Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009)

1.      Gelatinisasi larutan pati yang digunakan untuk substrat.

-         Sebanyak 40 ml larutan pati 1% (Soluble starch) ditambahkan dalam 50 ml air medidih di gelas beaker sambil diaduk.

-         Larutan kemudian didinginkan hingga mencapai suhu ruang.

-         Ditambah dengan aquades hingga volume tepat 100 ml.

2.      Pembuatan larutan baku/ standar (stock solution)

-         Larutan gelatinisasi pati diambil sebanyak 1 ml.

-         Ditambah aquades hingga volume tepat 100 ml kemudian dihomogenkan.

3.      Pembuatan Kurva Standar dan Uji Amilase

-         Larutan baku diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan dalam 3 tabung reaksi.

-         Ditambah 3 ml buffer fosfat 0,1 M pH 5,6.

-         Ditambah 1,5 ml ekstrak amilase dan campuran diinkubasi pada suhu 37°C.

-         Setelah diinkubasi, campuran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan pada tabung reaksi yang berisi 3 ml HCl 10% untuk menghentikan reaksi.

-         Ditambah 3 ml indikator (larutan iodin – kalium iodida).

-         Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm.

-         Prosedur diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit.

-         Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.

C.     Analisa Prosedur

Aktivitas alfa-amilase secara umum ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati, biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan pengurangan derajat pewarnaan iodium terhadap substrat. Pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan iodium menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bereaksi dengan iodium berwana coklat. Keaktifan alfa-amilase juga dapat dinyatakan dengan pengukuran viskositas dan jumlah produksi yang terbentuk. Laju hidrolisis akan meningkat bila polimerisasi menurun dan laju hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus (Winarno, 1986).

Metode untuk analisa enzim amilase di atas memiliki prinsip yang sama, yaitu mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim amilase dalam waktu tertentu.

1.      Analisa Prosedur Ekstraksi Enzim Amilase:

Prinsip utama dalam ekstraksi enzim amilase adalah mengambil enzim amilase yang terdapat pada sampel dengan pelarut (buffer atau akuades). Enzim amilase diharapkan dapat larut sempurna pada pelarut yang digunakan. Amilase yang larut kemudian disentrifuse dengan kecepatan tinggi selama beberapa menit agar residu sampel tidak ikut ter-analisa pada saat pengujian aktivitas enzim. Setelah disentrifuse, sisa residu dalam sampel (yang lolos dari penyaringan) akan mengendap di dasar tabung sentrifuse sedangkan supernatan yang didapat merupakan enzim amilase beserta pelarut yang kemudian akan digunakan untuk analisa selanjutnya.

Pada metode di atas digunakan pelarut buffer asetat 0,2 M pH 5, buffer fosfat (pH 5,5), serta akuades. Perbedaan penggunaan pelarut dapat bergantung pada sampel yang digunakan selain itu penggunaan buffer bertujuan agar enzim yang di dapat tetap stabil. Namun, Laloknam et. al (2009) menyebutkan bahwa penggunaan larutan buffer atau akuades memiliki fungsi yang sama dan keduanya dapat juga dipakai sebagai kontrol negatif aktivitas enzim amilase.

2.      Analisa Prosedur Deteksi Enzim Amilase:

Prinsip utama dalam mendeteksi keberadaan enzim amilase adalah hidrolisis pati (starch) yang ditandai dengan daerah terang pada agar di sekitar lubang yang telah ditetesi sampel. Starch agar yang dibuat mengandung pati yang merupakan karbohidrat kompleks. Enzim amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase dapat mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa. Enzim amilase pada sampel akan menghidrolisis pati pada agar. Hal ini dapat diketahui dengan terlihatnya daerah terang pada starch agar. Penambahan larutan iodin pada agar bertujuan untuk memperjelas daerah terang yang terbentuk. Aktivitas enzim amilase masing-masing sampel juga dapat ditentukan dengan perbandingan diameter daerah terang yang terbentuk pada agar.

3.      Analisa Prosedur Uji Aktivitas Enzim Amilase:

ü      AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007)

Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 3 menit dan suhu optimum 30^oC. Reaksi kemudian dihentikan dengan penambahan DNS (3,5 dinitro salicilic acid). Selain itu reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) akan bereaksi dengan gula pereduksi hasil hidrolisis dan mengakibatkan terbentuknya warna tertentu. Sampel kemudian didihkan agar reagen DNS dapat bekerja dengan cepat, setelah itu didinginkan dengan air mengalir. Penambahan 20 ml akuades untuk pengenceran sampel. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 550 nm. Metode ini terlebih dahulu membuat kurva standar glukosa antara konsentrasi glukosa dalam berbagai macam konsentrasi dan absorbansi. Kemudian konsentrasi sampel yang didapat melalui kurva standar dimasukkan ke dalam rumus untuk mendapatkan aktivitas enzim amilase.

ü      Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993)

Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu 5 menit dan suhu optimum 37^oC. Penambahan akuades sebanyak 20 ml bertujuan untuk mengencerkan sampel. Setelah itu, ditambahkan larutan I₂. Larutan I₂ akan bereaksi dengan sisa pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim amilase dan menghasilkan warna biru. Semakin banyak pati yang tersisa berarti aktivitas enzim amilase semakin kecil, dengan ditandai dengan degradasi warna biru. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Aktivitas enzim diukur dengan memasukkan nilai absorbansi ke dalam rumus, dengan satuan aktivitas enzim adalah S.C. (”Street-Close”).

ü      Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009)

Tahap pertama metode ini adalah gelatinisasi atau likuifikasi pati sehingga menghasilkan larutan starch yang baku. Larutan ini kemudian digunakan sebagai substrat dalam mereaksikan dengan sampel yang mengandung enzim amilase. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu tertentu dan suhu optimum 37^oC. Reaksi ini kemudian dhentikan dengan menambahkan larutan HCl 10%. Setelah itu ditambahkan indikator iodin-kalium iodida. Menurut Teodoro dan Meire (2000), larutan indikator dibuat dengan 0,05% iodin dalam 0. 5% KI. Sisa pati yang tidak terhidrolisis akan bereaksi dengan indikator sehingga menghasilkan warna tertentu. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Proses tersebut merupakan pengukuran pada jam ke-0. Langkah pengujian aktivitas enzim diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit. Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu kemudian diukur dengan kurva standar pati (substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.

D.    Penutup

Metode pengukuran aktivitas enzim amilase di atas memiliki prinsip utama yang sama, yaitu mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim amilase dalam waktu tertentu. Pengukuran hasil hidrolisis substrat yaitu monosakarida (gula reduksi) menggunakan reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid), sedangkan pengukuran sisa substrat (pati) yang tidak bereaksi dengan enzim menggunakan larutan I₂ atau indikator iodin-kalium iodida. Serapan pada sampel yang terbentuk diukur pada panjang gelombang tertentu. Untuk pengukuran menggunakan reagen DNS diukur pada panjang gelombang 550 nm, sedangkan jika menggunakan larutan I₂ atau indikator iodin-kalium iodida diukur pada panjang gelombang 620 nm.

DAFTAR PUSTAKA

Afiukwa, et. al. 2009. Determination of amylase activity of crude extract from partially germinated mango seeds (Mangifera oraphila). African Journal of Biotechnology Vol. 8 (14), pp. 3294-3296, 20 July, 2009. ISSN 1684–5315. Available online at http://www.academicjournals.org/AJB.

Anonim. 2008. Amilase. Tersedia dalam http://ptp2007.wordpress.com/2008/05/15/amilase/. diakses tanggal 28 November 2011

Biogen. 2008. Amilase. Tersedia dalam http://biogen.litbang.deptan.go.id/terbitan/agrobio/abstrak/agrobio_vol.           diakses tanggal 28 November 2011.

Inchem. 2008. Alpha-Amylase From Bacillus Subtilis. Tersedia dalam http://www.inchem.org/ documents/jecfa/jecmono/v28je05.htm. diakses tanggal 28 November 2011.

Kunamneni, Adinarayana et. al. 2005. Amylase Production in Solid State Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces lanuginosus. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 100, No. 2, 168- 171. DOI: 10.1263/jbb.100.168. The Society for Biotechnology, Japan.

Laloknam, Surasak et.al. 2009. Detection of amylase activity from fruit and vegetables in an undergraduate classroom. As. J. Food Ag-Ind. 2009, 2(03), 381-390. ISSN 1906-3040. Available online at www.ajofai.info

Oliveira. 2004. Rhizobia Amylase Production Using Various Starchy Substances as Carbon Substrates. Tersedia dalam http://www.scielo.br/pdf/bjm/v31n4/a11v31n4.pdf. diakses tanggal 28 November 2011.

Ramansyah, Maman dan I Made Sudiana. 2003. Optimasi Analisis Amilase Dan Glukanase Yang Diekstrak Dari Miselium Pleurotus ostreatus Dengan Asam 3,5 Dinitrosalisilat. Berk. Penel. Hayati: 9 (7-12). 2003

Soeka, Yati Sudaryati dan Eddy Djajasukma. 1993. Pengaruh Penambahan Sumber-Sumber Nitrogen Terhadap Aktivitas Enzim Alpha-Amilase Aspergillus niger Dalam Media Campuran Onggok dan Dedak. Pros. Seminar Hasil Litbang SDH 14 Juni 1993

Suarni dan Rauf Patong. 2007. Potency of Mung Bean Sprout As Enzyme Source (α-amilase). Indo. J. Chem., 2007, 7 (3), 332-336

Teodoro, Carlos Eduardo de Souza and Meire Lelis Leal Martins. 2000. Culture Conditions For The Production Of Thermostable Amylase by Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology (2000) 31:298-302. ISSN 1517-8382

Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia